實時熒光定量PCR可以用來精確測定DNA濃度嗎

2023-05-15 11:30:14 字數 2346 閱讀 9906

1樓:匿名使用者

不是用來測濃度的,可以用來做基因的拷貝數。測濃度最經典的還是紫外分光光度計,當然會有偏差,不過總體來說還是可以的。也可以用酶標儀。

2樓:北京索萊寶科技****

實時熒光定量pcr不是用來測濃度的,可以用來做基因的拷貝數。但是如果你的產物單一,有相應的標準品,也是可以測濃度的,濃度的準確性和你的標準曲線相關。

實時熒光定量pcr:

實時熒光定量pcr( realtime fluorescence quantitative pcr,rtfq pcr) 是1996 年由美國applied biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術,它是通過熒光染料或熒游標記的特異性的探針,對pcr產物進行標記跟蹤,實時**監控反應過程,結合相應的軟體可以對產物進行分析,計算待測樣品模板的初始濃度。

檢測指標是:各樣品的目的基因和管家基因分別進行realtime pcr反應。pcr產物與 dna ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,goldview染色,檢測pcr產物是否為單一特異性擴增條帶。

精確測定dna濃度的方法:

dna純度和濃度的檢測:分光光度(紫外吸收)法

1.預熱紫外分光光度計10-20分鐘。

2.取所需的比色杯(4ml),其中一隻裝入3 mlh2o溶液,作為空白液,用來校正分光光度計零點及調整透光度至100。

3. dna純度及濃度的測定:

取3微升的dna樣品加入比色杯,加dh2o至3000微升,混勻。

將比色杯置入分光光度計中,調入射光波長,分別用空白溶液調整零點(t為100,od為0),測待測樣品在260nm、280nm、230nm的od值。

計算濃度:dna濃度(ug/ml)=a260×50ug/ml×稀釋倍數。

對於雙鏈dna od260=50 ug/ml

對於單鏈rna od260=40 ug/ml

4. 純的dna溶液其od260/od280應為,od260/od230應大於。

od260/od280大於時,說明有rna汙染,小於時表明有蛋白質或酚汙染。

實時熒光定量pcr的結果該怎樣分析?

3樓:群英鬥將

1、如果有標準曲線,按照標準曲線計算;

2、一般都是相對量,則用delta delta ct方法來計算;

3、引物或探針降解:可通過page電泳檢測其完整性;

4、模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;

5、看ct值是分析熒光定量pcr最直觀的一個資料,ct值一般在35左右就失去參考價值了,平時我們實驗室用biodai-pcr熒光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。

4樓:南京金益柏生物科技****

用2-△△ct法算的話,應如何算? 假設檢測a基因,ct分別為(這裡記住ct越大,表明相對含量越低) 普通組/test1:28 實驗組1/test2:

29 實驗組2/test3:30 這時候要設對照了,假設test1為對照組(普通組),當然是以普通組為對照 那麼,相對含量為。

5樓:匿名使用者

看ct值、起始拷貝數、標準偏差等。

如果是sybr做的話,再看下溶解曲線。

實時熒光定量pcr注意事項

6樓:瀕危物種

1.按照正確的開關機順序操作,有助於延長儀器的使用壽命,減少儀器出故障的頻率。開機順序:

先開電腦,待電腦完全啟動後再開啟定量pcr儀主機,等主機面板上的綠燈亮後即可開啟定量pcr的收集軟體,進行實驗。關機順序:確認實驗已經結束後,首先關閉訊號收集軟體,然後關掉定量pcr儀主機的電源,最後關閉電腦。

2.應該定期備份您的實驗資料,備份頻率推薦每週一次,用光碟燒錄。同時您也應該備份定量pcr儀的各種純熒光光譜校正檔案、背景檔案和安裝驗證實驗資料,這些檔案所在的目錄是c:

電源:推薦配備合適的ups或穩壓器。

通風:儀器的通風應該沒有阻擋。

溫度:推薦實驗室配備空調,溫度應該控制在10-30°c之間。

空間:易於操作,安全。

4.怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被汙染?怎樣清除汙染。

一個辦法是執行背景校正反應板,當一個或多個反應孔連續顯示出不正常的高訊號,則表明該孔可能被熒光汙染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下,執行roi的校正,當某個孔的訊號明顯高出其他孔時,則表明該孔被汙染。

清除樣本加熱塊汙染的步驟如下:用移液器吸取少量乙醇並滴入每個汙染的反應孔中。吹打數次。

將廢液吸入廢液杯中。重複以上步驟:乙醇三次,去離子水三次。

確認反應孔中的殘留液體蒸發完。

實時熒光定量PCR的個體重複問題

最好是不要,這樣會減小重複之間的誤差。特別是需定量的樣品,混樣對定量結果的準確性是有影響的 實時熒光定量pcr的重複性好是什麼意思 3個實驗重複的ct值的標準差在0.167以內 abi的標準 我們一般在0.5以內就可以了 實時熒光定量pcr的結果該怎樣分析?1 如果有標準曲線,按照標準曲線計算 2 ...

實時熒光定量pcr加入的cdna的a260 280很低,有影

沒有bai影響,實時熒光定du量pcr quantitative real time pcr 是一種在zhidna擴增反應中,以熒光化dao 學物質測每次聚合版酶鏈式反應 pcr 迴圈 實時熒光定量pcr,cdna的加入量會影響結果的準確度嗎 兩者沒有必然的聯絡,準確度一般是儀器決定的,不同的儀器準...

熒光定量pcr的原理,熒光定量PCR的原理

pcr擴增時在加入一對引復物的同時制加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收 剛開始時,探針結合在dna任意一條單鏈上 pcr擴增時,tap酶的5 端 3 端外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團...