1樓：名傑**
熒光定量pcr（real-time pcr）是目前基因表達定量分析的重要檢測手段，已經為越來越多的研究者所採用。「好的開始是成功的一半」，perrez-novo等(perrez- novoet al., 2005)曾報道獲得高質量rna對後續pcr定量結果的準確性是非常重要的，而高質量rna是獲得高質量cdna的必要條件，所以本文著重介紹一下如何獲得高質量cdna。
高質量cdna應具備以下幾個特點：無基因組dna殘留、能準確反應出樣本真實的轉錄情況和資訊完整且濃度適當等特點。
高質量cdna應保證無基因組dna殘留
在提取rna的過程中，常常會有基因組dna的殘留，從而導致實驗結果的不準確性或假陽性結果的出現。 2023年，nature protocol的一篇關於熒光定量pcr實驗研究的文章1中明確指出，在合成cdna第一鏈之前應去除基因組dna殘留，以免cdna中有基因組dna的存在，影響高靈敏度的熒光定量pcr實驗結果：
另外和試劑盒也有關係，我們都從杭州昊鑫生物訂艾德萊的試劑盒，挺好用的
2樓：商松針冰蝶
定量pcr最好每個樣本有三個重複，每次試驗做三遍比較可靠。因為比較靈敏，有微小差異會影響很大。並且記得檢查每個孔是否有誤差很大的數值，如果有誤差很大的孔建議刪掉這個結果，可能是膜沒有密封好
用熒光定量pcr的方法進行相對定量其結果的穩定性，可信度如何？
3樓：蠢羊羊
定量pcr最好每個樣本有三個重複，每次試驗做三遍比較可靠。因為比較靈敏，有微小差異會影響很大。並且記得檢查每個孔是否有誤差很大的數值，如果有誤差很大的孔建議刪掉這個結果，可能是膜沒有密封好
4樓：匿名使用者
rt-pcr每個樣品做3個平行樣最好（其實2個也可），平行樣之間迴圈數相差在0.2之內較為可靠。結果內中有一個圖是看特容異性的，如果峰值基本都在同一位置，則再看不同樣品間迴圈數的結果較為準確。
同時還要設立內參，以確定樣品結果的可信性。
其實我也是剛剛接觸，說的不知道清楚不清楚，也不知道對你有沒有幫助。
實時熒光定量pcr的結果該怎樣分析？
5樓：群英鬥將
1、如果有標準曲線，按照標準曲線計算；
2、一般都是相對量，則用delta delta ct方法來計算；
3、引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性；
4、模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；
5、看ct值是分析熒光定量pcr最直觀的一個資料，ct值一般在35左右就失去參考價值了，平時我們實驗室用biodai-pcr熒光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。
擴充套件資料：
pvr的迴圈引數：
1、預變性；
模板dna完全變性與pcr酶的完全啟用對pcr能否成功至關重要，加熱時間參考試劑說明書。
2、變性步驟；
迴圈中一般95℃，30秒足以使各種靶dna序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。
3、引物退火；
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對pcr的特異性有較大影響。
4、引物延伸；
引物延伸一般在72℃進行（taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
5、迴圈數；
大多數pcr含25-35迴圈，過多易產生非特異擴增。
6、最後延伸；
在最後一個迴圈後，反應在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全，並使單鏈產物退火成雙鏈。
6樓：南京金益柏生物科技****
用2-△△ ct法算的話，應如何算？ 假設檢測a基因，ct分別為（這裡記住ct越大，表明相對含量越低） 普通組/test1：28 實驗組1/test2：
29 實驗組2/test3：30 這時候要設對照了，假設test1為對照組（普通組），當然是以普通組為對照 那麼，相對含量為。
7樓：匿名使用者
看ct值、起始拷貝數、標準偏差等
如果是sybr做的話，再看下溶解曲線
如何分析熒光定量pcr實驗結果
8樓：南京金益柏生物科技****
如果是realtime做表達
抄量，用襲excel的製圖，將每個個體的ct值平均數bai做出柱狀圖就可以了。du如果你還
zhi做了標曲的話，dao
就用製圖中的散點圖看r2值。
其實這些功能做定量pcr的時候電腦程式應該會自動分析才對，具體情況具體分析。
如何看熒光定量pcr的結果
9樓：南京金益柏生物科技****
按公式計算：對照組-δδct ＝對照組（ct 目的基因－ct 內參基因）－對照組（ct 目的基因－ct 內參基因）
熒光定量pcr的結果（ct值）怎麼分析
10樓：匿名使用者
目的基因熒光達到閾值時的迴圈數～ct值越低代表起始模板數量越大～
實時定量pcr的結果是怎樣分析的
11樓：小乾乾
1、如果有標準曲線，按照標準曲線計算。
2、一般都是相對量，則用delta delta ct方法來計算。
3、舉例如下：對照組基因a的ct值為20， 內參（比如βactin)ct值15。實驗組基因a ct值18，內參ct值14。
4、首先算加樣量：delta ct=15-14=1。2的1次方是2。
也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因a: delta ct=20-18=2。
2的2次方是4。也就是說基因a的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。
5、幾點注意：必須確定擴增的特異性，只有相同目標的ct值才能相減（擴增效率有可能不同），2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2，最好不用syber green。
12樓：豆村長de草
實時熒光定量pcr技術是在pcr反應體系中加入熒光基團，利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
基線在pcr擴增反應的最初數個迴圈裡，熒光訊號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。光域值threshold的設定，一般將pcr反應前15個迴圈的熒光訊號作為熒光本底訊號，熒光域值是pcr3-15個迴圈熒光訊號標準差的10倍，熒光域值設定在pcr擴增的指數期。
融解曲線是用來驗證擴增產物特異性的，如果產物是單一條帶，融解曲線就會出現一尖峰；如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現至少兩個尖峰。
擴充套件資料：
時熒光定量pcr儀real-time qpcr 常見問題分析：
1、無ct值出現
1）檢測熒光訊號的步驟有誤：一般sg法採用72℃延伸時採集，taqman法。則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號；
2）引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性；
3）模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；
4）模板降解：避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
2、ct 值出現過晚（ct>38）
1）擴增效率低:反應條件不夠優化，設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等；
2）pcr各種反應成分的降解或加樣量不足，
3）pcr產物太長：一般採用80-150bp的產物長度。
3、標準曲線線性關係不佳
1）加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度；
2）標準品出現降解：應避免標準品反覆凍融，或重新制備並稀釋標準品；
3）引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針；
4）模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
13樓：匿名使用者
實時定量pcr的結果是可以和所有核酸結合，沒有特異性。
要保證特異性的話，最好用其他的方法。擴增體系中加入模板dna的體積，比如同時10微升的體系，對照組加1微升dna，實驗組加2微升dna，則實驗組的加樣量是對照組的2倍。
看ct值是分析熒光定量pcr最直觀的一個資料，ct值一般在35左右就失去參考價值了，平時我們實驗室用biodai-pcr熒光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。
擴充套件資料：
real-time qpcr 常見問題分析：
一、無ct值出現
1、檢測熒光訊號的步驟有誤：一般sg法採用72℃延伸時採集taqman法。
則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號。
2、引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性。
3、模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
4、模板降解：避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
二、ct 值出現過晚（ct>38）
1、擴增效率低:反應條件不夠優化，設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等。
2、pcr各種反應成分的降解或加樣量不足。
3、pcr產物太長：一般採用80-150bp的產物長度。
三、標準曲線線性關係不佳
1、加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度。
2、標準品出現降解：應避免標準品反覆凍融，或重新制備並稀釋標準品。
3、引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針。
4、模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
四、負對照有訊號、溶解曲線不止一個主峰
1、引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和髮夾結構的出現。
2、引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下游引物的濃度配比。
3、鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix 試劑盒。
4、模板有基因組的汙染：rna提取過程中避免基因組dna 的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
五、擴增效率低
1、反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
2、反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
3、反應體系中有pcr反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
14樓：寵愛認
常見分析角度：
1.無ct值出現
（1）檢測熒光訊號的步驟有誤：一般sg法採用72℃延伸時採集，taqman法則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號；
（2）引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性；
（3）模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；
（4）模板降解：避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
2.ct 值出現過晚（ct>38）
（1）擴增效率低:反應條件不夠優化，設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等；
（2）pcr各種反應成分的降解或加樣量不足，
（3）pcr產物太長：一般採用80-150bp的產物長度。
3.標準曲線線性關係不佳
（1）加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度；
（2）標準品出現降解：應避免標準品反覆凍融，或重新制備並稀釋標準品；
（3）引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針；
（4）模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
4.負對照有訊號、溶解曲線不止一個主峰
（1）引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和髮夾結構的出現；
（2）引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下游引物的濃度配比；
（3）鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix 試劑盒；
（4）模板有基因組的汙染：rna提取過程中避免基因組dna 的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
5.擴增效率低
（1）反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解；
（2）反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法；
（3）反應體系中有pcr反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
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