1樓：匿名使用者
不管酶切還是pcr，都是間接的結果。要確定克隆的正確，一定要測序的啊。
你測個序，問題就迎刃而解了。到底是什麼問題也就清楚了。
2樓：匿名使用者
因為 轉化過程你沒出來好 加點 kml 再轉化 提質後 分別切2 這樣就正確了
菌落pcr會出現假陽性結果嗎
3樓：匿名使用者
高手們好。最近做酶切連線轉化，最後做鑑定時，以菌落為模板進行pcr時可以見到有目的條帶;當把菌落接種到lb液擴菌後，以菌液為模板進行pcr時卻什麼東東都沒有?請問會是什麼原因啊?
多多指教啊!建議重新以菌落為模板進行pcr檢測，再重新以菌液為模板進行pcr檢測，因為菌落或者菌液pcr假陽性的機率還是比較高的。但如果還是出現以上結果，推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的，此時建議再提質粒做pcr檢測和酶切檢測來徹底證明你的目的片段是否真正與載體連線成功。
個人的見解希望對你有所幫助，也期望高手們批評指正!我覺得菌落pcr效果很好，雖然有假陽性的可能，但是只要是做出來，有目的條帶一般是對的，你為什麼還要用菌液做pcr?你還不如搖菌後提取質粒然後用質粒pcr或者酶切。
既然你說到這個問題了，我覺得很有可能是你的質粒被稀釋了，因為在菌落中的濃度比較大。另外也有可能是你根本就沒有挑到正確的菌落來搖菌，所以就沒有質粒，怎麼能做出來。我覺得你做菌液的pcr和菌液的pcr必須是從單一的一個菌落挑出來的，如果不是，那肯定只有一個是正確的，我做過，只要是同一菌落不會有差錯。
你再試試看，祝你成功!謝謝各位高手的及時的回答。現在我都是挑單個菌落後搖菌，然後提取質粒，然後以質粒為模板做pcr，陽性的質粒再酶切進行鑑定，效果還可以。
再次謝謝大家!!!第二次看到這種觀點，不確定對不對，借道跟大家討論一下，不知道lcc有沒有文獻支援一下這種觀點?如果這種觀點正確，那我以前很多關於t載體的看法就錯了，所以很感興趣。
我一直以為外面的dn**段會被大腸桿菌分泌出來的核酸酶降解。 lcc_0 wrote:推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的說來也很奇怪，以前我就是挑菌後加到lb液後搖菌，然後以菌液為模板進行pcr，再以陽性管提取質粒進行酶切鑑定，排除陰性管，這樣可以少提一些質粒。
最近菌液pcr總是陰性，所以就直接提質粒進行鑑定了。其中原因真的不知道是什麼?我也遇到過，也許是塗抹的轉化產物導致的加陽性(菌落pcr)。
各位大大，我倒是碰到過菌液pcr是陰性，但是有質粒的情況，酶切也正確。一般我以為質粒抽屜和酶切鑑定是最保險的。pcr假陽性。
假陰性的概率都很高。菌液的問題在於鹽!鹽會干擾pcr。
如果用菌液的話，可以用水洗滌離心幾次，然後重懸於水，就可以了。 題外話:最近菌落pcr，陰性和陽性對照經常不擴增，而樣品擴增，鬱悶啊。
4樓：匿名使用者
條帶兩端上揚這種情況在跑電泳很常見，一般把電壓調低點跑久點會改善，有時候膠沒有做好也會出現這樣的情況，注意拔梳子的時候一定要平衡。以前做克隆的時候，陰性對照模板用水擴增也出現過有條帶，就像你最後一個泳道。老闆說是汙染了，把所有的試劑全部換新的，而且加樣條件也非常注意，後來就沒有條帶了。
5樓：匿名使用者
菌落pcr的結果參考價值比較下，假陽性太厲害。還是以測序結果為準。可以在測序之前做一下質粒酶切驗證
菌落pcr和菌液pcr在原理和操作方面有什麼區別
6樓：匿名使用者
如果轉化成功的話，菌落裡的菌就含有你克隆的質粒載體了，用槍頭直接碰一下，然後作為pcr模板，就可以進行pcr擴增了。但是菌落pcr鑑定的假陽性率其實也不低，所以建議你挑取菌落擴培之後抽提質粒，進行酶切鑑定，這樣比較準確，酶切鑑定確認好之後再去測序以確定沒有鹼基突變或缺失。
你說的t7通用引物是指載體上的t7 promtor引物嗎？那只是一條引物啊，如果加上gbh下游引物的話，擴增出來的就是你連線進去的目的基因的長度了。
質粒連線目的片段，菌液pcr後電泳有目的條帶，為什麼送菌液測序結果是空載體呢 ？
7樓：exo不偷井蓋
1、你bai
的實驗目的是什麼？ 2、如果du是克zhi隆，連線t載體後不用酶dao
切，直接轉化菌專落pcr檢測有目屬
的條帶的話送樣測序即可。 3、如果是做表達載體構建，pcr產物和質粒dna酶切後與沒有酶切的在同一塊膠上電泳，如果兩個酶切位點很近，幾乎看不到被切下來的小片段條帶（太小，早就跑出去了）。你要是怕酶切不完全就多稍微加點酶，切的時間長一點。
4、關於酶切產物有幾條帶視酶切效果而定，酶切完全則兩條，一大一小（小的可能看不到，原因見3、）酶切不完全則三條帶，一大一小及未切開的pcr產物；質粒的話可能還多一條環狀分子和線狀分子的區別。
8樓：落葉來也
確定有目的條帶麼?
如果確定連上了，可能就是挑菌的時候不是單菌落，重新挑，或者原點再取點，塗布或者劃線。
菌落pcr結果正確，為什麼搖菌提質粒酶切不對？
9樓：瑞棟璇淼
通用來引物加特異性引物源菌落pcr+質粒雙酶切 均陽bai性 具特異性證明（縫拼接除du外）
認雙酶切實驗能夠zhi更嚴謹驗證重組實dao驗 更具說服力基組測序知道您重組質粒否酶切解環與線性空載體進行比 瓊脂糖凝膠電泳本身存定範圍內誤差 若目片段 立體dna結構瓊脂糖凝膠誤差放 能影響實驗結
根據您實驗結 我猜測重組質粒陰效能性更些
既已經抽提質粒 妨做質粒pcr雙酶切 品塊凝膠內平行跑結目
基因工程中，載體與載體連線物，目的基因與目的基因連線物，目的基因與載體連線物分別是指什麼，滿意的話
經過同一種限制性內切酶切割後會產生相同的粘性末端，所以目的 基因可內與目的基因連線，載體可與載容體連線，也有目的基因和載體連線。用限制性內切酶切了以後，讓片段自己連線，就會出現三種連線方式，然後我們選擇出來需要的重組片段 基因工程構建基因表達載體的問題 我估計這個構建是利用你提到的酶切位點在你所說的...
（2）中的「目的基因 目的基因載體 載體」是說它們自己和
朋友你好！將目的基因克隆進某載體的基本過程如下 擴增目的基因 此時的目的基因連在舊載體上，且基因兩側有多個限制性酶切位點，即處在多克隆位點內，整體呈環形，因為也只有正常環形dna即質粒能在細菌內擴增 提純目的基因，並利用單酶切或雙酶切將其切下 此時目的基因呈線性，且兩端是酶切過後留下的粘性末端 酶切...
T載體與目的基因連線成功,測序結果也正確。從新搖菌,提取
解決辦法 bai1 cla1是一個比較不常見的酶,du可能酶切體系和 zhiecor1的緩衝dao體系不一樣,試著分別回酶切,就是先切cla1,然答後純化後切ecor1 或者查詢哪個酶的酶切效率高些,那個後切 2 3個小時可能太短了,我一般都是5個小時,或者過夜 3 可能是你菌挑錯了,或汙染了,重新...